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抗体条形码eCLIP:快速、微量、高通量的蛋白质-RNA检测技术

更新时间:2024-05-16      点击次数:417
 RNA和蛋白质相互作用研究主要通过紫外交联和免疫沉淀(CLIP)技术,但即便是目前最新的增强型CLIPeCLIP)技术,在改进了RNA片段文库制备方法的基础上,也需要4天的时间才能完成一次实验,且缺乏并行处理多个RNA结合蛋白(RBP)的能力。

20221222日,来自加州大学圣地亚哥分校的Gene W. YeoKaren B. Chapman研究组合作在Nature MethodsBrief Communication形式发表题为Multiplexed transcriptome discovery of RNA-binding protein binding sites by antibody-barcode eCLIP的文章,提出了一种新的抗体条形码eCLIPantibody-barcode eCLIP, ABC)方法,极大提高了CLIP技术的便捷性和效率。

CLIP技术无法大规模应用主要存在两个限制因素。第一,所有基于CLIP的方法都通过SDS-PAGE分离蛋白然后转移到硝化纤维膜,依据分子量大小选择免疫沉淀蛋白-RNA复合物。这种人工切蛋白质-RNA复合物条带的方法很繁琐,需要额外的1.5-2天,并且容易受到操作者之间差异的影响。第二,每个单独的RBP需要特定的免疫沉淀IP步骤,这对研究多个RBP所需的原始材料数量造成了负担。针对以上两个问题,研究团队人员通过加入DNA条形码抗体,优化了eCLIP的两个限制,允许基于珠上近距离的连接on-bead proximity-based ligations取代SDS-PAGE和膜转移步骤。此外DNA条形码还可以区分同一样品中不同RBP,极大地降低了每个RBP起始样品量研究人员将这种方法命名为抗体条形码eCLIPantibody-barcode eCLIP, ABC具体流程如下图

 

 

具体地,研究人员使用两种特征明确的RBP评估抗体条形码eCLIP新方法,分别是RNA结合Fox-1同源物2 RBFOX2,它识别GCAUG基序,以及茎环结合蛋白SLBP,它与组蛋白mRNA特异性相互作用。研究结果表明抗体条形码eCLIP常规eCLIP得到的结果基本一致,如下图。这也验证了体条形码eCLIP方法的可行性和准确性。

 

 

抗体条形码eCLIP的一个决定性优势是可以从单个样本中同时检测多个RBP因此研究人员K562细胞中选择了9个先前ENCODE3中报道过的RBP来展示基因区域内已知结合位点的多样性其中包含5' UTR中的DDX3EIF3G3' UTR中的IGF2BP2FAM120APUM2ZC3H11ACDS中的LIN28B3'剪接位点SF3B45'剪接位点下游PRPF8经过比对分析表明抗体条形码eCLIP和单独eCLIP方法检测结果相似,见下图。

 

 

综上所述,研究人员提出了一种称为抗体条形码eCLIP的新方法,在使用单一eCLIP实验相同材料的基础上不仅简化了操作流程同时也极大增加一次性检测RBP通量,这将有助于样品来源稀少,且往往投入有限的临床标本检测。

 

参考文献

1. Ule, J., Jensen, K., Mele, A. & Darnell, R. B. CLIP: a method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells. Methods 37, 376–386 (2005).

2. Wheeler, E. C., Van Nostrand, E. L. & Yeo, G. W. Advances and challenges in the detection of transcriptome-wide protein-RNA interactions. Wiley Interdiscip. Rev. RNA 9, e1436 (2018).

3. Hafner, M. et al. CLIP and complementary methods. Nat. Rev. Methods Primers 1, 20 (2021).

4. Daniel L. et al. Multiplexed transcriptome discovery of RNA-binding protein binding sites by antibody-barcode eCLIP. Nature Methods 20, 65–69 (2023).

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