小动物活体成像技术为生命科学研究提供了无创、动态观察生物过程的强大工具。然而，要获得科学、可靠且具有统计学意义的结果，严谨的实验设计至关重要。其中，对照设置、时间点选择和样本量规划是确保实验成功与结论可信的三大基石。
一、对照设置：
对照组是实验设计的“标尺”，用于排除非特异性信号和系统误差。
阴性对照：这是较核心的对照。例如，在研究肿瘤生长时，应设置未接种肿瘤细胞的健康动物作为阴性对照，以确认背景信号(如自发荧光)水平。在基因治疗研究中，注射空载体或无关序列的动物可排除载体本身的影响。
阳性对照：用于验证成像系统和模型的有效性。例如，在测试一种新的抗肿瘤药物时，可设置一个已知有效的阳性药物组，确保实验系统能检测到预期的治疗效果。
空白对照(仅适用于荧光成像)：对于使用外源性荧光探针的实验，需设置未注射探针但其他处理相同的动物，以评估组织自发荧光的干扰。
假手术/处理对照：当实验涉及手术或特殊处理时，需设置仅进行相同操作但不实施关键步骤(如不注射细胞、不结扎血管)的对照组，以排除操作本身造成的应激反应。
二、时间点选择：
活体成像的优势在于其动态性，合理选择时间点能完整描绘生物过程的演变。
基线扫描：在干预(如给药、接种)前进行初次扫描，获取每个动物的本底信号，用于后续的自身对照和数据归一化。
动态监测：根据研究目标的生物学过程速度来设定。急性过程(如炎症、药物分布)可能需要分钟或小时级别的密集扫描；慢性过程(如肿瘤生长、神经退行)则需数天、数周甚至数月的定期监测。关键是要覆盖过程的起始、高峰和消退(或稳定)阶段。
终点验证：实验结束时，通常需要进行组织学、分子生物学等离体分析，将活体成像结果与“金标准”进行关联验证。
三、样本量规划：
样本量过小，统计效力不足，可能无法检测到真实差异(假阴性)；样本量过大，则违背3R原则(减少、优化、替代)。应基于预实验数据，使用统计学方法(如功效分析)计算所需样本量。需考虑预期效应大小、数据变异性(标准差)和可接受的显著性水平(α)与统计功效(1-β)。通常，每组5-10只动物是常见范围，但具体需根据实验设计严谨计算。
精心设计的对照、科学规划的时间点和合理计算的样本量，是小动物活体成像研究从“好看图片”走向“可靠科学发现”的必经之路。忽视这些原则，再先进的仪器也难以产出高质量的科研成果。
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