荧光素酶报告基因实验步骤讲解

更新时间：2026-02-10 点击次数：61

　　荧光素酶报告基因实验是一种利用荧光素酶(Luciferase)与底物反应产生生物发光，来检测基因表达调控的灵敏技术，广泛应用于基因表达调控、转录因子活性、信号通路及药物筛选等领域。

　　荧光素酶报告基因实验步骤：

　　质粒构建

　　靶启动子插入：将感兴趣的基因启动子或调控元件(如转录因子结合位点)克隆至荧光素酶表达载体(如pGL3-basic、pGL4系列)的上游。

　　内参载体选择：常用pRL系列载体(如pRL-CMV、pRL-TK)，启动子活性需适中(如TK启动子)，避免干扰主报告基因。

　　特殊载体：

　　pmirGLO：FLuc为主报告基因，RLuc为内参，适用于miRNA研究。

　　psiCHECK：RLuc为主报告基因，FLuc为内参，但酶切位点少，不适用于miRNA研究。

　　细胞转染

　　细胞选择：常用HEK293T、293细胞，也可根据实验需求选择其他细胞系。

　　转染方法：磷酸钙沉淀法、PEI、Lipofectamine 2000等。

　　质粒比例：双质粒系统中，内参质粒与报告基因质粒比例约为1:10，确保内参不影响主报告基因表达。

　　转染时间：瞬时转染后24-36小时检测，稳定转染需筛选单克隆。

　　细胞裂解与样本处理

　　裂解液：使用PLB裂解液(Promega)裂解细胞，收集裂解液。

　　离心：12,000 rpm离心5分钟，取上清用于检测。

　　荧光检测

　　仪器：发光检测仪(Luminometer)或酶标仪(带化学发光模块)。

　　检测顺序：

　　加入FLuc底物(Luciferin + ATP)，检测主报告基因荧光值。

　　加入RLuc底物(Coelenterazine + Stop缓冲液)，检测内参基因荧光值。

　　注意事项：

　　底物需避光保存，反应时确保底物过量。

　　检测时间控制在10秒内，避免信号衰减。

　　样品和试剂需平衡至室温后再检测。

　　数据分析

　　相对光强度(RLU)：计算主报告基因与内参基因的荧光值比值。

　　归一化处理：将实验组RLU除以对照组平均RLU，得到相对活性。

　　结果展示：以柱状图展示对照组和实验组的归一化值。