FISH技术服务实验流程 从样本制备到结果分析

FISH技术服务（荧光原位杂交）是一项将分子生物学与细胞形态学紧密结合的精密技术。其核心在于利用荧光标记的核酸探针，在细胞核原位与靶DNA进行特异性结合，从而在显微镜下实现“所见即所得”的遗传信息可视化。一套严谨的FISH实验流程，是确保定性、定位及相对定量分析结果准确性的生命线。
 

样本质量是FISH成功的基石。对于临床最常见的石蜡包埋组织切片，流程始于严格的脱蜡与水化。必须使用二甲苯和梯度乙醇去除石蜡，恢复组织的通透性。随后，进行关键的蛋白酶K消化。这一步如同“拆墙”，目的是适度酶解细胞核周围的蛋白质网络，暴露双链DNA，但又不能过度消化导致组织碎片化或细胞核流失。对于细胞涂片或外周血样本，则需通过固定液（如甲醇：冰醋酸=3:1）保持细胞形态完整并去除RNA酶干扰。制备完成的样本应在-20℃下妥善保存，防止DNA降解。
 

探针与靶DNA的杂交是技术的核心化学反应。首先进行共变性：将含有探针的杂交液滴加于样本上，覆盖盖玻片，置于杂交仪或金属加热块上。在82℃至85℃的高温下，探针和样本中的双链DNA同时解链变性为单链，此过程约5-10分钟。紧接着是退火与复性：迅速将温度降至37℃至42℃（依据探针Tm值设定），并保温过夜（4-16小时）。在此孵育期内，标记了报告分子（如生物素）的探针单链凭借碱基互补配对原则，寻找并牢固结合到细胞核内同源互补的靶序列上，形成稳定的杂交体。
 

杂交后，必须洗去未结合及非特异性结合的探针，以降低背景噪音。使用预热的SSC缓冲液进行严谨性洗涤：先用较高温度（如72℃）的洗液去除结合不牢的探针，再用室温洗液漂洗。如果探针是间接标记（如标记生物素），则需进行信号放大：滴加荧光素标记的亲和素或抗体，使其与探针上的报告分子结合。对于微弱信号，可进行多层抗体放大（如抗亲和素抗体+荧光标记二抗），将化学信号转化为明亮的荧光信号。
 

在暗室环境中，使用配备特定激发块（如DAPI/FITC/TRITC）的荧光显微镜进行观察。DAPI染色使细胞核呈现蓝色背景，便于定位。分析时需遵循“盲法”原则，由两名经验丰富的技术人员独立计数。针对不同应用，判读标准各异：基因扩增（如HER2）需计数至少20个细胞核，计算红绿信号比值；基因易位（如ALK）需观察分离信号的比例；染色体数目异常需统计着丝粒探针的拷贝数。最终，将镜下离散的荧光斑点转化为具有临床意义的分子病理报告，为精准诊断提供铁证。

fish技术服务技术

产品介绍

fish技术服务技术（Fluorescence In Situ Hybridization）是一种物理图谱绘制方法， 将DNA (或 RNA)探针用特殊的核苷酸分子标记，然后将探针直接杂交到染色体或 DNA 纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测 DNA 序列在染色体或 DNA 纤维切片上的定性、定位、相对定量分析

实验原理

如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物的素，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。

实验流程

荧光原位杂交实验流程 FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→ (染色体显带)→荧光显微镜检测→结果分析

实验结果