miRNA荧光定量检测服务标准曲线构建与内参基因筛选指南

构建标准曲线：为绝对定量确立标尺

标准曲线是实现绝对定量的基础，其核心是建立已知拷贝数与检测信号（Ct值）之间的精确对应关系。构建一条高质量的标准曲线，需遵循以下关键步骤：

1. 制备高纯度标准品：首先，需要合成或制备已知序列的目标miRNA，并通过精确的浓度测定（如紫外分光光度法）和拷贝数换算，获得初始标准品。

2. 进行梯度稀释：将标准品按等比例（如10倍）进行系列稀释，通常至少设置5-7个浓度梯度，覆盖样本中目标miRNA可能的表达范围。稀释过程必须精准且一致，避免产生误差累积。

3. 执行qPCR反应：将每个梯度的标准品作为模板，在相同的反应条件下进行荧光定量PCR检测，记录每个浓度的Ct值。

4. 绘制与评估标准曲线：以标准品拷贝数的对数值为横坐标，测得的Ct值为纵坐标，绘制标准曲线。评估曲线质量的关键指标包括：

   • 相关系数（R²）：反映曲线的线性关系，理想的R²应大于0.99，越接近1，说明定量越准确。

   • 扩增效率（Efficiency）：由斜率计算得出，理想的扩增效率应在90%-110%之间。效率过高可能提示有引物二聚体干扰，过低则可能反应条件不佳。

待测样本的Ct值代入这条已验证的标准曲线，即可换算出其初始模板中目标miRNA的绝对拷贝数或浓度。

筛选内参基因：为相对定量校准偏差

对于大多数基因表达研究，相对定量是更常用的方法，其准确性高度依赖于内参基因的稳定性。内参基因相当于“分子天平”，用以校正样本间在RNA提取、反转录效率上的差异。筛选理想内参基因的策略如下：

1. 选取候选基因：选择多个在样本中普遍表达且表达水平相对恒定的miRNA作为候选，如U6 snRNA、SNORD44（又称RNU44）、SNORD48（又称RNU48）等，具体选择需结合样本类型（如组织、血清、细胞）参考相关文献。

2. 评估表达稳定性：通过预实验检测所有候选基因在实验各组样本中的Ct值。理想的稳定内参，其Ct值在不同样本组间的波动应非常小。

3. 借助算法软件：单纯凭肉眼观察不够严谨，可借助专门的算法工具（如geNorm、NormFinder、BestKeeper）对候选基因的稳定性进行评分。这些软件能分析基因的表达变异，推荐最稳的组合。例如，geNorm可以通过计算平均表达稳定值M，筛选出M值低（通常<1.5）的基因。

4. 使用组合内参：为了降低偏差，现代研究常建议使用2-3个稳定内参基因的几何平均数作为最终的校正因子，这比依赖单个内参更稳健。

总而言之，无论是选择外参法构建精准的标准曲线，还是筛选稳定的内参基因进行相对定量，其根本目的都是为了在复杂样本中还原miRNA表达的真实面貌。一套严谨的验证流程，是确保后续所有生物学解读和结论坚实可信的前提。

 

miRNA荧光定量检测服务

产品介绍

Real Time PCR，即实时荧光定量PCR，也被称为定量PCR或qPCR，是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法

由于定量PCR具有操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低等优点，被广泛应用于医学检测、药物疗效考核、基因表达研究、转基因研究、基因检测、病原体检测、动植物检测、食品检测等各种领域

实验原理

所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法

实时荧光定量PCR技术类型概述: DNA结合染料法, 基于探针的化学法, 猝灭染料引物法

实验应用

DNA及RNA定量；基因表达验证；等位基因鉴别；SNP分型；病原体和病毒检测；多重PCR

实验结果