细胞划痕实验标准操作步骤

　　细胞划痕实验(Wound Healing Assay)是体外模拟伤口愈合过程，快速评估贴壁细胞迁移运动能力的经典基础实验，操作简便无需特殊设备，广泛用于药物、基因干预对肿瘤转移、上皮修复等过程的迁移影响研究。
 

　　实验前准备：
 

　　‌核心材料‌：处于对数生长期的目标贴壁细胞、培养基、无血清/低血清培养基、无菌DPBS缓冲液、200μl无菌枪头、6孔板、直尺、马克笔、带拍照功能的倒置显微镜。
 

　　‌环境预处理‌：超净台提前开启紫外灯照射30分钟完成灭菌，所有操作全程在无菌环境下进行，避免细胞污染。
 

　　细胞划痕实验标准操作步骤：

 

　　‌孔板预标记‌：用马克笔在6孔板底部，借助直尺每隔0.5~1cm画一道均匀横线，每孔至少穿过5条线，后续划痕与横线垂直相交，这些交叉点就是后续固定拍照的定位点，解决不同时间点找不到同一视野的问题。
 

　　‌细胞铺板‌：消化细胞并充分吹打成单细胞悬液，调整接种密度，确保过夜培养后细胞能100%融合形成均匀单层，无空洞、无局部细胞堆积。
 

　　‌制造标准化划痕‌：弃去原有培养基，将无菌枪头紧贴直尺，垂直于孔板底部的标记线匀速划过细胞层，力度保持一致，只划破细胞层不划伤板底，每孔划3~5条平行划痕，保证初始划痕宽度均匀。
 

　　‌清洗除杂‌：沿孔板壁缓慢加入预温的无菌DPBS，轻柔冲洗2~3次，洗掉划落的悬浮细胞碎片，避免残留细胞后续贴壁造成“假愈合”，之后吸去DPBS，加入无血清或血清浓度<2%的新鲜培养基。
 

　　‌定点定时拍照‌：将孔板置于显微镜下，以0小时为初始时间点，在每个交叉点位置固定视野拍照记录初始划痕宽度；随后将孔板放入37℃、5% CO₂培养箱继续培养，根据细胞迁移速度，在12h、24h、48h等预设时间点回到相同的视野位置再次拍照。